عملي ميكروبيولوجي - ترم 2 (جزء1 )

عملى الميكروبيولوجى



by agar diffusion method


أولا الأدوات اللى بتستلمها
ماصة 5 مل
ماصة 1 مل
Pasteur pipette
Loop
حامل الأنابيب فيه
أنبوبة الوزرمان اللى فيها ال culture
أنبوبة فيها saline
أنبوبة فيها antibiotic
4 أنابيب فاضية
2 طبق
فلاسكة الاجار
وكل الأدوات الزجاجية ملفوفة فى ورق و معقمة طبعا


ثانيا الأدوات المطلوبة منك
Glass pencil
مسطرة وورقتين
الجزء الكاوتش بتاع ال Pasteur



ثالثا ال procedure
i1- preparation of seeded agar


i1-leave melted agar to cool to 50 – 55°


أول حاجة لما تاخد الاجار بتشوف درجة حرارته وغالبا هيبقى لسه سخن
هتحطه على بنش خشب او على الاطباق


المهم مش على البنش البلاط مباشرة لان الاجار ممكن يبرد من تحت ويجمد ويمسك فى الفلاسك ومش تعرف تصبه فى الاطباق


وبتتابع درجة حرارة الاجار لحد ما توصل من 50 ل 55 علشان تبدا تحضر ال seeded agar


طيب ليه عند درجة الحرارة دى ؟


ليه مش أقل ؟


ليه مش أعلى ؟


طيب وازاى أعرف انه وصل للدرجة دى من غير ترمومتر ؟




i2-Add 0.1 ml of culture


لما الاجار يوصل لدرجة الحرارة دى هاضيف الculture


قبل ما أضيف ال culture أعمل shaking للوزرمان



وأستخدم الماصة ال 1 مل


أنقل كام ؟


0.1 مل


مش باخد آخر 0.1 مل لانه مش بينزل كله وهو كله أصلا نقطتين !!!


طيب الماصة بتتفتح ازاى ؟


النهاية اللى لها tail بتبقى لفوق


بتسحب الجزء اللى فوق


وتتاكد انك ماسك الماصة كويس ومتحكم فيها وبعدين تسحب الجزء التانى من الورقة لتحت



i3-Shake clockwise and anticlockwise


بعد ما تضيف ال culture تعمل mixing كويس عن طريق ال


shaking clockwise and anticlockwise


بس بالراحة علشان مش يتكون air bubbles فى الاجار


4-Pour into 2 petri dishes


تبدا تصب الاجار فى الطبقين


أثناء الصب بافتح الغطاء جنب ال flame بزاوية 45 درجة وأبدا الصب


الصب فى الطبق بيكون مرة واحدة يعنى مش توقف الا لما الاجار فى الطبق يوصل للاطراف كلها


تاخد بالك ان الصب بيبقى فى الطبق اللى هو الجزء الاصغر


( الجزء الأكبر هو الغطاء ) وده مش بنصب فيه


i 5-Place on flat surface and Allow agar to solidify


ولما تخلص صب تقفل الطبق وتتأكد انه على مكان مستوى من البنش علشان لما يبرد يبقى سمك الاجار واحد فى الطبق كله

2 - Preparation of 2 fold serial diluition




i 1-Mark the 3 empty test tubes as 2 , 3 , 4





i 2-Mark the antibiotic tube as 1





i 3-Transfer 2 ml of sterile saline into each empty sterile test tube





مهم هنا




مش بنضيف saline فى الأنبوبة رقم 1 اللى هى أصلا أنبوبة ال antibiotic علشان مش نغير تركيزه





i 4-Transfer 2 ml from 1 to 2 and mix





i 5-Transfer 2 ml from 2 to 3 and mix





i 6-Transfer 2 ml from 3 to 4 and mix





i 3 – Making of cups





i 1-On a paper draw the sites of the 4 cups





أرسم محيط الطبق ( الجزء السفلى أو الجزء الاصغر ) مش الغطاء على ورقة والطبق طبعا طبعا مقفول




وعلشان كده الاحسن أميل القلم وانا بارسم




وبعدين أرسم القطرين بتوع الدايرة وأقيس 2,5 سم من مركز الدايرة فى الأربع اتجاهات




ولما أجى أعمل ال cups هتبقى النقط دى فى مركز الوزرمان




وممكن يكون الطبق مش نفس الحجم




يبقى ترسم لكل طبق ورقة لوحده





i 2-Make the cups Using sterile wesserman tube by flaming with alcohol





وبعد كده اشوف الاجار جمد ولا لسه




أعرف ازاى ؟




اروح اخد وزرمان من البيكر اللى على البنش




اتاكد ان حافتها مساوية وناعمة




أحطها فى الكحول وبعدين احطها فى ال flame ثوانى




مش باستخدمها على طول فى عمل ال cups وهى سخنة




ليه ؟





لانها وهى سخنة هتسيح الاجار وال cups تبوظ




بافتح الطبق برده بزاوية 45 تقريبا جنب الفلام و بادخل بالوزرمان عمودى بالظبط لحد لما أسمع صوت الوزرمان بيخبط فى الطبق من تحت





i 3-Remove the cups by sterile loop





برده باحطه فى الفلام علشان أعقمه لحد لما يبقى لونه أحمر




ومش باستخدمه وهو سخن كده




هاسيبه يبرد ثوانى وبعدين ابدا أشيل ال cups




برده بادخل بال loop عمودى علشان باقى الاجار ميتجرحش




علشان أعمل الخطوة دى بامسك الطبق بالغطاء وأقلبهم على البنش يعنى الطبق بقى لفوق والغطا لتحت




أسيب الغطاء على البنش جنب الفلام طبعا




وأرفع الطبق مواجه للفلام واشيل ال cups





i 4-Mark the holes as 1 , 2 , 3 , 4





بارقم ال cups بحيث




رقم 1 تبقى قصاد رقم 2




ورقم 3 قصاد رقم 4




والترقيم بيكون على الطبق مش الغطاء






i 4 -Application of antibiotic





i 1-Transfer 2 drops of each antibiotic concentration to the corresponding cup





يعنى من الانبوبة رقم 4 لل




cup




رقم 4 وهكذا




Starting with the lowest concentration ( no . 4 )i




Using pasteur pipette





فى الخطوة دى




بأبدأ بأقل تركيز




وأحطه فى الطبقين




وبعدين التركيز الأعلى منه وهكذا




طيب سؤال لو فرضا حصل ونسيت وبدأت بتركيز أعلى




ايه الحل ؟




بتغسل الباستير بال saline




يعنى تسحب فيها شوية سالين وترميه





كمية ال antibiotic اللى هتحطها فى كل cupلازم تكون ثابتة




يعنى نقطة أو اتنين فى كل cup بس أهم حاجة تثبت الكمية فى كل ال cups فى الطبق الواحد




المفروض بتحط نقطتين فى كل cup




لكن لو حسيت ان سمك الاجار قليل ممكن تكتفى بنقطة واحدة علشان ال antibiotic مش يطلع بره ال cups




فتح ال Pasteur ازاى ؟؟




بافتح جزء صغير من فوق خالص




واركب الكاوتش بتاعتها اللى المفروض تكون جايبها معاك




خلى بالك فى الخطوة دى ان طرف الباستير رفيع جدا وضعيف وممكن يتكسر( بالراحة)




خلاص بعد ما تركب الكاوتش بتشيل باقى الورقة اللى عليها




ممكن تركن طرف الباستير على حافة الطبق علشان لو ايدك بتتهز ال antibiotic مش يقع على الاجار بره ال cup




وبعد الخطوة دى




مهمممممممممم




مش تميل الطبق لان ال antibiotic ممكن يتحرك ويطلع من ال cup على الاجار و





i 5 -Incubate at 37° for 24 hours





الخطوة دى مش الطلبة اللى بيعملوها يعنى كده خلاص التجربة خلصت






بتسلم اييييييييييييه ؟؟؟




الطبقان بس و بتكتب عليهم اسمك ورقمك بال glass pencil


طيب ايه ال comment اللى بتكتبه فى ورقة الإجابة ؟؟

أول حاجة تعريف ال MIC

تانى حاجة ال procedure

وأهم نقط فيها ومش ينفع تنساها

انى باحضر ال seeded agar at 50 – 55
انى باجهز ال antibiotic dilutions by 2 fold serial dilution
انى فى خطوة ال application بابدأ ب lowest dilution
انى باعمل incubation at 37° for 24 hours

تالت حاجة بتتكتب ال calculation
يعنى الجدول المعروف ده
على فرض انك بادئ ب
Conc = 1000 Mg / ml
هيبقى كده



مهم جداااااااااااا
الوحدات
وبعدين تعرف ايه هى ال a , b , x
A = diameter of inhibition zone in mm
B = diameter of cup in mm
X =( a – b) / 2

وممكن توضح هما ايه بالرسم أحسن



بعد كده بترسم ال curve


تخيلى طبعا لان مش معاك نتايج ال a وبالتالى مش معاك ال x2





طبعا لاااااااااااااااااازم امتداد ال curve يقطع فى المحور x أو المحور السينى
و يبقى ال

MIC = anti log MIC = …. Mg / ml

وممكن كمان ترسم شكل الطبق بعد ما يخرج من الincubator وتبين ترقيم ال cups




طيب التصحيح بيبقى على أساس ايه

1- انك تكون ضفت ال culture وده هيظهر من ال growth

2- Homogenous distribution of culture
وده بيعتمد على خطوة ال mixing

3- شكل ال cups وانها تكون فى مكانها الصحيح

4- شكل ال inhibition zone وحجمها

5- هل فيه contamination وده هيعتمد على شغلك جنب الفلام

6- مستوى الاجار فى الطبق يبقى واحد وعلشان كده لازم تحط الطبق بعد ما تصب الاجار على مكان مستوى تماما من البنش

7- ان مفيش antibiotic على سطح الاجار

الصورة دى فيها طريقة قياس ال a





الشغل كله جنب الفلام فى حدود 20 سم منه

الترتيب فى أول خطوتين مش ثابت
يعنى ممكن تحضر ال
seeded agar
قبل عمل ال
serial dilution
أو العكس تبع درجة حرارة الاجار

بالنسبة لوقت الامتحان
هيبقى عندك فترتين انتظار
وقت لما الاجار يبرد قبل الصب ممكن توصل ربع ساعة
ووقت لما الاجار يجمد بعد الصب وقبل عمل الكبس حوالى 10 دقايق

تعمل فيهم ايه ؟؟

فى الوقتين دول ممكن
تكتب الكلام النظرى

وترسم الاطباق على الورق وتحدد مكان ال كبس

وتعمل ال
serial dilution



انتهت التجربة الأولى